В современном мире от результативности работы системы защиты растений на объектах производства овощных культур напрямую зависит их экономическая эффективность. Основным принципом, которым необходимо руководствоваться при грамотной организации системы защиты растений, выступает тезис: профилактика лучше, чем лечение.
Особенно актуально это для борьбы с возбудителями вирусных инфекций.
Существует множество способов профилактики вирусных заболеваний, при этом количество эффективных мер противодействия вирусным инфекциям растений на этапе проявления симптомов весьма ограниченно. Это объясняется особенностями иммунитета растений и приводит к развитию эпифитотий в тепличных комбинатах.
Система защиты растений в тепличных комбинатах состоит из мер по предупреждению появления фитопатогенных инфекций, и мер по реагированию на уже проявляющееся заболевание. В качестве методов профилактики вирусных болезней можно использовать обработку семенного материала, дезинфекцию поверхностей тепличного комбината, карантинное регулирование, плановую диагностику растений на патогены, утилизацию больных растений, селекционную работу по выведению устойчивых (толерантных) гибридов, борьбу с вредителями и др.
В случаях, когда эпифитотия уже началась, методы профилактики теряют свою актуальность, необходимо перейти к более серьезным способам борьбы с вирусами.
В первую очередь следует установить карантинные меры и определить какое из множества возможных вирусных заболеваний поразило популяцию растений. Здесь можно выделить такие приемы, как карантин, обработка противовирусными препаратами, пестицидами, инсектицидами, выбраковка сильно пораженных растений, стимуляция роста и эффективный контроль над питанием растений. Большинство из указанных мер являются традиционными и используются в большинстве тепличных комбинатов. В данной работе мы хотим остановиться на биологическом способе противовирусной защиты растений, так как в сравнении с химическими пестицидами он является более экологичным и не представляет опасности для здоровья человека.
За последние три года тепличные хозяйства России, занимающиеся производством томата, все чаще сталкиваются с вспышками заболевания, вызываемого вирусом желтой курчавости листьев томата (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV, ВЖКЛТ), который является разрушительным патогеном, вызывающим до 100% потери урожая.[21]
Симптомы вируса жёлтой курчавости листьев томата
К ним относятся: задержка роста, скручивание листьев наверх, хлороз, уменьшение площади листьев и отсутствие плодов (рис.1). Проявления варьируют в зависимости от возраста заразившихся растений, устойчивости сорта и условий окружающей среды. Растения, инфицированные вскоре после высадки, останавливаются в росте и не образует плодов. При поражении инфекцией растений на более поздних этапах вегетации первые симптомы появляются примерно через 2 недели после инокуляции. [9, 15, 16]
Название вирусу дали в начале 1960-х годов для описания инфекции, передаваемой белокрылкой Bemisia tabaci, который поражал культуры томатов в Израиле [1, 12, 13, 14]. С начала 1970-х готов вспышки ВЖКЛТ стали встречаться чаще. К концу 1970-х годов вирус встречался практически во всех регионах Ближнего Востока, которые занимались выращиванием томатов [2, 17, 18]. К концу XX века он распространился по всему миру [3, 4, 5, 6].
Накопленные за последние два десятилетия знания о вирусе позволяют сделать вывод о том, что он наносит непоправимый экономический вред хозяйствам, возделывающим культуры томата. Известно, что некоторые виды диких томатов, такие как Solanum pimpinellifolium, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites и S. cheesmaniae, толерантны к ВЖКЛТ.
Гены устойчивости (Ty-1 и Ty-6) от этих диких видов были интрогрессированы в культивируемые сорта томатов. Это позволило вывести сорта, толерантные к вирусу, однако устойчивость никогда не достигала 100% [10, 11]. Таким образом, разработка и исследование новых средств защиты растений томата от TYLCV является важной задачей современной науки.
Новосибирскими учеными было разработано средство на основе эндонуклеазрестрикции «Enzyme-ФИТО», которое представляет собой комплекс ферментов, гидролизующих вирусные нуклеиновые кислоты, тем самым снижая вирусную нагрузку на растение и нивелируя воздействие вируса на растение [7, 8, 19]. На данный момент средство испытано на многих вирусах растений, таких как вирус зеленой крапчатой мозаики огурца, вирус обыкновенной мозаики огурца, вирус мозаики томата, вирус табачной мозаики и других. Общей чертой этих возбудителей является то, что они все содержат РНК, тогда как ВЖКЛТ является ДНК-содержащим вирусом [4, 20]. Исходя из этого, целью нашей работы стало изучение эффективности применения «Enzyme-ФИТО» против ВЖКЛТ на растениях томата. Для оценки эффективности способа противовирусной защиты растений от ДНК-содержащих вирусов были проведены лабораторный и полевой эксперименты.
Защита томата от вируса курчавости листьев с препаратом Enzyme-ФИТО
Маршрутные обследования показали, что в 2018 году было поражено 63,5% растений томата в хозяйстве. Проявления выражались в задержке роста, хлорозе, курчавости листовой пластины и отсутствием плодоношения, либо нарушениями товарной формы плодов у подавляющего большинства инфицированных растений.
В 2019 году в осенний севооборот при обработке «Enzyme-ФИТО» из 10500 кустов томата 30 кустов были поражены ВЖКЛТ. Таким образом, процент поражения растений в хозяйстве составил 0,3%. Инфицированные растения отставали в росте, листья скручивались, присутствовал хлороз. Однако цветение и плодоношение сохранялось. Таким образом, обработки «Enzyme-ФИТО» после появления первого настоящего листа и до образования 3 настоящего листа, а также в течение 6 недель после высадки, способствует значительному сокращению числа пораженных ВЖКЛТ растений.
Маршрутные обследования показали, что в 2018 году было поражено 63,5% растений томата в хозяйстве. Проявления выражались в задержке роста, хлорозе, курчавости листовой пластины и отсутствием плодоношения, либо нарушениями товарной формы плодов у подавляющего большинства инфицированных растений.
В 2019 году в осенний севооборот при обработке «Enzyme-ФИТО» из 10500 кустов томата 30 кустов были поражены ВЖКЛТ. Таким образом, процент поражения растений в хозяйстве составил 0,3%. Инфицированные растения отставали в росте, листья скручивались, присутствовал хлороз. Однако цветение и плодоношение сохранялось. Таким образом, обработки «Enzyme-ФИТО» после появления первого настоящего листа и до образования 3 настоящего листа, а также в течение 6 недель после высадки, способствует значительному сокращению числа пораженных ВЖКЛТ растений.
Исследования проводились на базе двух испытательных площадок: лабораторного центра и тепличного хозяйства. В лабораторном эксперименте оценивали эффективность действия «Enzyme-ФИТО» на вирус в условиях in vitro и in vivo на рассаде томата. Далее исследования продолжили на базе одного из тепличных хозяйств республики Дагестан. Оценивали эффективность «Enzyme-ФИТО» в качестве средства профилактики ВЖКЛТ при выращивании растений томата в условиях защищенного грунта, а также эффективность применения препарата на этапе проявления симптомов. Данный регион был выбран нами в силу широкого распространения изучаемой инфекции на всей территории республики.
Проведен экспериментальный подбор концентраций раствора «Enzyme-ФИТО» in vitro, для профилактических обработок томата. В пробирки с пробами, содержащими вирус, вносили растворы «Enzyme-ФИТО» рабочей концентрации 10, 25 и 50 единиц активности (ЕА) на 10 мкл. После инкубации и инактивации ферментов из материала выделяли ДНК вируса, которую использовали для амплификации специфического участка генома ВЖКЛТ с детекцией результатов в режиме реального времени.
Для опыта in vivo было отобрано 60 растений рассады томата российской селекции с симптомами поражения вирусом желтой курчавости листьев томата. Проявления симптомов начались на 30-й день вегетации. Наличие патогена подтвердили молекулярно-генетическим методом (при помощи ПЦР-диагностики). ДНК вируса обнаружили в каждом из растений. Томаты были разделены на 2 группы: опытную и контрольную. В каждой группе было по 30 штук. Растения опытной группы обрабатывали рабочим раствором «Enzyme-ФИТО» каждые 3 дня, всего было проведено 18 обработок. Вегетация растений осуществлялась с постоянным контролем микроклимата при относительной влажности воздуха не менее 65% и температуре не менее 24°C.
В течение всего эксперимента проводили визуальную оценку состояния растений с составлением скрининговой карты. Оценивали всю выборку растений по следующей шкале: 1 балл – внешне здоровое растение; 2 балла – растение с начальными признаками инфекции (легкая курчавость листьев верхушки); 3 балла – выраженная курчавость листьев верхушки; 4 балла – деформация (опухоль) верхушки (рис.2).
Совокупность растений в полевом опыте составила 10500 растений томата. Общая площадь посадки томата составляла 0,48 га защищенного грунта с высадкой в почву. Рассаду обрабатывали с момента появления первого настоящего листа до третьего настоящего листа с интервалом 4 дня. Всего было проведено 6 обработок. После высадки 1 с интервалом раз в неделю в течение 6 недель. Рабочая концентрация раствора «Enzyme-ФИТО» составила 150 ТЕА на 10 литров воды. Опрыскивание проводили мелкодисперсным ручным распылителем.
В 2018 году данный тепличный комбинат столкнулся с эпифитотией ВЖКЛТ. Растения не обрабатывали противовирусными препаратами ни в качестве профилактики, ни во время явных проявлений вируса. Так как условия вегетации растений в 2018 и 2019 годах были сопоставимы и значительных различий не имели, данные по общей площади посадки, распространению вирусной инфекции и количеству собранного урожая в 2018 году были использованы нами в качестве контроля в данном эксперименте. Общая площадь посадки томата в 2018 году составляла 0,96 га защищенного грунта с высадкой в почву. Всего было высажено 22400 растений томата. После рассадного отделения растения были высажены в два блока по 0,48 га в каждом, на каждый блок приходилось 11200 растений томата.
Для оценки фитосанитарного состояния посадок использовали метод маршрутных обследований. Для этого осматривали все растения в каждом третьем ряду в шахматном порядке вдоль центральной дорожки. Количество больных и здоровых растений фиксировали в скрининговых картах. Степень поражения больных растений оценивали по описанной выше шкале.
Оценка эффективности препарата Enzyme-ФИТО в борьбе с ВЖКЛТ
Исследования in vitro показали, что «Enzyme-ФИТО» разрушает как белковую оболочку, так и ДНК вируса желтой курчавости листьев томата, что хорошо визуализируется на графиках, полученных в результате ПЦР-исследований. На рисунке 3 видно, что пробы с добавлением «Enzyme-ФИТО» в концентрации 10, 25, и 50 единиц активности не показали экспоненциального роста.
Повышение уровня флуоресценции, который выражается на графике в виде равномерно поднимающихся вверх линий, говорит о наличии амплифицирующихся неспецифических участков гидролизованной вирусной ДНК. Тогда как пробы без добавления противовирусного средства показывают экспоненциальный рост кривой флуоресценции, являющейся следствием накопления специфического участка ДНК ВЖКЛТ и, следовательно, его присутствия в исследуемом образце. Полученные результаты постановки подтверждались негативными и позитивными контролями каждого из этапов проведенного исследования.
Данные опыта in vivo на рассаде томата не показывают значительных различий между контрольной и опытной группами. Так, по оценке фитосанитарного состояния растений, представленных в таблице 1 видно, что на начало эксперимента симптомы ВЖКЛТ на рассаде томата опытной и контрольной групп проявлялись одинаково. В среднем, в контрольной группе сила проявления симптомов на 11.05 составила 2,64 балла, на опытной – 2,66. Через 9 дней проявление симптомов ВЖКЛТ существенно не изменилось (P>0,05) и составило 2,65 балла. Тогда как в контрольной группе среднее значение проявления симптомов незначительно снизилось до 2,45. Далее, вплоть до окончания эксперимента показатель снижался соответствующим образом как в опытной, так и в контрольной группах, и на конец эксперимента составил 2,05 балла в каждой из групп.
Для более глубокого изучения динамики силы проявления симптомов ВЖКЛТ определили, как изменялось количество растений с тем или иным значением данного показателя.
Так, на рисунке 4 видно, что с 11.05 по 01.06 количество растений с 1 баллом выросло в 4 раза в опытной и в 7 раз в контрольной группе. Однако на конец эксперимента, 29.06, количество растений с 1 баллом составило 16 для опытной и 14 для контрольной группы. На опытной группе с 11.05 по 29.05 количество растений с силой проявления симптомов равной 2 баллам снизилось с 14 до 8 и в опытной, и в контрольной группах. Число растений, оцененных в 3 балла, с 11.05 по 29.05 в опытной группе сократилось с 10 до 6, в контрольной с 13 до 7. Количество растений с силой проявления симптомов равной 4 баллам на начало эксперимента составляло 3 и 1 в опытной и контрольной группах соответственно. В последний день эксперимента в опытной группе не было зарегистрировано растений с силой проявления симптомов 4 балла, в то время как в контрольной группе было 4 таких растения.
Растения, оцениваемые в 4 балла, имели опухоль точки роста основного побега.
Для того, чтобы исключить бактерию как этиологический фактор возникновения данного симптома, было проведено гистологическое исследование опухоли части стебля и части стебля без проявления симптома. Клетки среза патологической ткани, части стебля деформированы и уплотнены, признаков бактериальной инфекции не обнаружено.
Необходимо обратить внимание на такой показатель, как индекс листовой поверхности. Для опытной группы данный показатель в конце эксперимента составил 0,355, для контрольной 0,354. Средняя площадь листа в опытной группе составила 18,2 см², на контрольной 19,6 см². При этом количество листьев в опытной группе равнялось 390, в контрольной 360. При незначительно отличающихся данных (Р>0,05) растения опытной группы были более облиственными, с большей площадью и более насыщенной окраской листовых пластин. Растения, у которых отмечалась опухоль точки роста, компенсировали развитие основного стебля боковым побегом. В контрольной группе растения с опухолью точки роста останавливались в росте, боковые побеги развивались слабо (рис.5).
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что на этапе проявления симптомов ВЖКЛТ на рассаде томата эффективность противовирусных обработок оказалась низкой, что согласуется с литературными данными. Это может быть связано с высокой вирусной нагрузкой, которая является критической для роста растений.
В связи с этим, тепличным комбинатам с высоким риском поражения ВЖКЛТ рекомендуем обрабатывать рассаду томата, начиная с появления первого настоящего листа
В случае, если растение уже инфицировано, либо инфицирование произошло в рассадном блоке, профилактические обработки не позволят накопить вирусную нагрузку до критических значений.
Данное утверждение было подтверждено результатами эксперимента на базе тепличного хозяйства республики Дагестан.
Как видно из таблицы 2, в период осеннего севооборота в 2018 году при площади посадки 0,96 га и количестве растений 22400 было собрано 44 тонны урожая. В среднем на каждом растении формировалось 3,5 кисти. В 2019 году было собрано 38 тонн урожая, однако площадь посадки составила 0,48 га и 10500 растений. Среднее количество кистей на кусте – 7. При пересчете на 0,48 га в 2018 году приходилось 19,2 тонн урожая, в 2019 году данный показатель составил 38 тонн.
Таким образом, сбор урожая увеличился на 97,8%. Данный факт можно связать с воздействием препарата «Enzyme-ФИТО» на рост и развитие растений, однако не следует исключать влияние других факторов.
Маршрутные обследования показали, что в 2018 году было поражено 63,5% растений томата в хозяйстве. Проявления выражались в задержке роста, хлорозе, курчавости листовой пластины и отсутствием плодоношения, либо нарушениями товарной формы плодов у подавляющего большинства инфицированных растений.
В 2019 году в осенний севооборот при обработке «Enzyme-ФИТО» из 10500 кустов томата 30 кустов были поражены ВЖКЛТ. Таким образом, процент поражения растений в хозяйстве составил 0,3%. Инфицированные растения отставали в росте, листья скручивались, присутствовал хлороз. Однако цветение и плодоношение сохранялось. Таким образом, обработки «Enzyme-ФИТО» после появления первого настоящего листа и до образования 3 настоящего листа, а также в течение 6 недель после высадки, способствует значительному сокращению числа пораженных ВЖКЛТ растений.
Пашковский С.Е., Научно-исследовательский центр «Инновации»
Рябинина В.А., Научно-исследовательский центр «Инновации»
Багамаев Р.С., Крестьянско-фермерское хозяйство «Победа»
Плотников К.О., Научно-исследовательский центр «Инновации»
Вышегуров С.Х., ФГБОУ ВО Новосибирский ГАУ
Блажко Н.В., Научно-исследовательский центр «Инновации»
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cohen & Harpaz, Entomologia Experimentalis et Applicata 7: 155, 1964.
2. Czosnek & Laterrot, Archives of Virology 142: 1391, 1997.
3. Navas-Castillo, Sánchez-Campos, Díaz, Sáez-Alonso & Moriones, Plant Disease 83: 29, 1999.
4. Martinez Zubiaur, Zabalgogeazcoa, De Blas, Sanchez, Peralta, Romero & Ponz, Journal of Phytopathology 144: 277, 1996.
5. Nakhla, Maxwell, Martinez, Carvalho & Gilbertson, Plant Disease 78: 926, 1994.
6. Polston, 2nd Intl. Workshop on Bemisia and Geminiviral Diseases, San Juan, Puerto Rico, L-40, 1998.
7. Zerbini, F.M. et al. (2017) ICTV virus taxonomy profile: Geminiviridae. J. Gen. Virol. 98, 131–133
8. Блажко Н.В. Противовирусная активность ферментного препарата на основе продуцентов Serratia marcescens (Фитовирин) при естественном и искусственном инфицировании овощных культур Tobamovirus / Н.В. Блажко, С.Х. Вышегуров, Ю.И. Хрипко, В.А. Рябинина, С.Е. Пашковский// Гавриш.- 2019. – № 1. – С.42-49.
9. Levy, D. and Lapidot, M. (2008) Effect of plant age at inoculation on expression of genetic resistance to Tomato yellow leaf curl virus. Arch. Virol. 153, 171–179
10. Navas-Castillo, J. et al. (1999) Tomato yellow leaf curl virus-Is causes a novel disease of common bean and severe epidemics in tomato in Spain. Plant Dis. 83, 29–32
11. Gill, U. et al. (2019) Ty-6, a major begomovirus resistance gene on chromosome 10, is effective against Tomato yellow leaf curl virus and tomato mottle virus. Theor. Appl. Genet. 132, 1543 –1554
12. Fondong, V.N. (2013) Geminivirus protein structure and function. Mol. Plant Pathol. 14, 635–649
13. Rojas M. R.,Hao Jiang, Salati R, Xoconostle-Ca´zares B, Sudarshana M. R., Lucas W. J., Gilbertson R. L. Functional Analysis of Proteins Involved in Movement of the Monopartite Begomovirus, Tomato Yellow Leaf Curl Virus // Virology. Vol. 291(1). P. 110–125
14. Alemandri, V. et al. (2015) Three members of the Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae cryptic species complex occur sympatrically in Argentine horticultural crops. J. Econ. Entomol. 108, 405–413
15. Czosnek, H. et al. (2017) The incredible journ
16. Papayiannis, L.C. et al. (2011) Identification of weed hosts of Tomato yellow leaf curl virus in Cyprus. Plant Dis. 95, 120–125
17. Czosnek, H., Ghanim, M., 2011. Bemisia tabaci – Tomato yellow leaf curl virus interaction causing worldwide epidemics. In: Thompson, W.M.O. (Ed.), The Whitefly, Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) Interaction with Geminivirus-Infected Host Plants: Bemisia tabaci, Host Plants and Geminiviruses. Springer Netherlands, Dordrecht, pp. 51–67.
